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细胞凋亡实验

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细胞凋亡实验

细胞凋亡方法原理:
本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。
 
细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,因而可进?#35874;?#32454;胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T)碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

细胞凋亡实验材料
人早幼粒白血病HL-60细胞
试剂、试剂盒
三尖杉酯碱Tris-HclEDTA缓冲液碱性裂解液SDS醋酸钠异丙醇乙醇溴酚蓝蔗糖指示剂TBE电泳缓冲液琼脂糖溴乙锭PI母液Ho33342母液
仪器、耗材
荧光显微镜电泳仪电泳槽微量加样器离心管载玻片盖玻片
实验步骤
一、试剂?#24613;?br /> 
1.  三尖杉酯碱(HT):300μg/ml;

2.  Tris-HCl(pH7.5):100mmol/L;

3.  EDTA缓冲?#28023;?mol/L;
4.   碱性裂解?#28023;?.2mol/L NaOH;

5.  醋酸钠:3mol/L KAc(pH4.8);

6.  PI母?#28023;?00μg/ml;

7.  Ho33342母?#28023;?mmol/L;

8.  人早幼粒白血病HL-60细胞:用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃,5% CO2条件下培养。

9.  其他:异丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、1%琼脂糖、溴乙锭。
 
 
二、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡
 
1.  实验前约24小时,接种两瓶HL-60细胞,标记①、②,?#31185;?#21547;约6 ml培养?#28023;?#32622;37℃,5%CO2培养箱培养。
 
2.  实验前约2.5小时,当细胞密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200 μl,使终浓度为1 μg/ml,②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。
 
3.  Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞
 
(1)染色:将瓶中的细胞摇匀取200 μl于1.5 ml的离心管中,加入Ho33342母液2 μl,PI 20 μl,染色15分钟。
 
(2)滴片:取一载玻片用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10 μl,加入小室内盖?#32454;?#29627;片,荧光镜下用紫外激发光,高?#27602;?#19979;观察,区别三种细胞,并注意三者比例。
 


注意事项
 
1.  诱导培养HL-60细胞时间要准确;
 
2.  荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。
其他
细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
 
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体后被吞噬细胞吞?#19978;?#21270;。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症?#20174;Α?br /> 
在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被?#30422;?#26029;,降解为180-200bp或它的整倍数的各?#21046;?#26029;。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,?#19978;?#31034;以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。
 
相比之下,坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症?#20174;Γ?#22351;死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。
 
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧?#39029;?#24230;和细胞本身对刺激的敏感程度。

 

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